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Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

Annexin V-Alexa Fluor 647/PI Apoptosis Detection Kit 

貨號(hào)：K2577     

保存：2-8  ℃避光保存 

組分說(shuō)明

Cat.No.                    K2577

KitSize                     50

4×BindingBuffer            10ml

PropidiumIodide,PI          500 μl

AnnexinV-AlexaFluor647    250 μl

產(chǎn)品簡(jiǎn)介 

   AnnexinV-AlexaFluor647/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒是一種采用AnnexinV-AlexaFluor647 與 PI 雙染法進(jìn)行細(xì)胞早期凋亡分析的檢測(cè)試劑盒。

   細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使  PS 暴露在細(xì)胞膜外表面。PS 是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使PS 暴露在細(xì)胞膜外。Annexin V 具有易于結(jié)合到磷脂類如PS 的特性，對(duì)PS 有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的PS。PS 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就被破壞。另外一種活細(xì)胞非透過(guò)性熒光染料碘化丙啶（PropidiumIodide,PI）不能通過(guò)完整的活細(xì)胞，但能夠?qū)乃篮偷蛲鐾砥诘募?xì)胞進(jìn)行染色，因此通常將AnnexinV 與PI 配合染色，以區(qū)別凋亡早期細(xì)胞與壞死細(xì)胞和凋亡的晚期細(xì)胞。

注意事項(xiàng) 

1.  消化細(xì)胞時(shí)不能用含EDTA 的胰酶。 

2.  本試劑盒需使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

3.  需自備PBS 和去離子水。

4.  熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，保存和使用過(guò)程中請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

5.  PI 對(duì)人體有刺激性，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)。

6.  請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

操作步驟 

1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：

    a. 對(duì)于貼壁細(xì)胞：小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用胰酶消化細(xì)胞，至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來(lái)時(shí)，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000×g 左右離心3-5 分鐘，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50 μl 左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1 ml 4℃預(yù)冷的    PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。再次加入1ml4℃預(yù)冷的 PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞。

    b. 對(duì)于懸浮細(xì)胞：1000×g 左右離心3-5 分鐘，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約                            50 微升左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約 1 ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到1.5 毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，可以殘留約                                50μl 左右的   PBS，以避免吸走細(xì)胞。再次加入1ml4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞。

2.  用去離子水按1:4 稀釋  BindingBuffer（4mlBindingBuffer+12ml 去離子水）；

3.  用 250μlBindingBuffer 重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106/ml；

4.  取100μl 的細(xì)胞懸液于5ml 流式管中，加入5μlAnnexinV/AlexaFluor647 和  10μl20μg/ml 的 PI 溶液；

5.  混勻后于室溫避光孵育15 分鐘；

6.  在反應(yīng)管中加400μlPBS，流式細(xì)胞儀（FACS）分析。

    

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